La transición de la industria farmacéutica hacia los reactivos en cascada recombinantes (rCR) para pruebas de endotoxinas bacterianas (BET) representa un avance significativo en sostenibilidad y confiabilidad. Sin embargo, la validación exhaustiva en diversos serotipos de endotoxinas y plataformas de prueba sigue siendo esencial para una adopción generalizada.
En colaboración con ACC, realizamos un estudio comparativo que examinó las características de rendimiento de los métodos de detección microfluídicos y tradicionales basados en placas que utilizan reactivos recombinantes. Esta investigación, presentada en la Conferencia de Microbiología Farmacéutica de la PDA, demuestra un rendimiento equivalente de estas plataformas en la detección de varios serotipos de endotoxinas bacterianas, incluidas las endotoxinas naturales, de múltiples fuentes bacterianas gramnegativas.
Nuestros hallazgos proporcionan datos de validación críticos que respaldan el uso de la tecnología rCR con una plataforma microfluídica avanzada, abordando preguntas clave sobre la recuperación del serotipo, la comparabilidad de la plataforma y el rendimiento analítico. Los resultados confirman que los reactivos recombinantes en cascada logran una recuperación y confiabilidad efectivas en diversas endotoxinas, lo que valida aún más su idoneidad como una alternativa sólida a los reactivos tradicionales de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) para pruebas de endotoxinas.
Antecedentes: tecnología rCR y métodos de detección de endotoxinas
Los reactivos recombinantes en cascada (rCR) representan una alternativa sostenible al LAL tradicional para las pruebas de endotoxinas bacterianas. Al aprovechar la tecnología recombinante, rCR replica toda la cascada LAL sin depender de recursos derivados del cangrejo herradura, alineándose con los objetivos de sostenibilidad de la industria. A medida que se expande la adopción de rCR, la validación integral de endotoxinas naturales de diversas fuentes bacterianas gramnegativas se vuelve cada vez más crítica.
Este estudio evalúa el rendimiento de PyroSmart NextGen® rCR en lipopolisacáridos (LPS) de múltiples especies bacterianas gramnegativas utilizando tres lotes comerciales independientes. Además, la investigación compara dos plataformas de detección, la plataforma BET Sievers Eclipse y las microplacas tradicionales de 96 pozos, para evaluar la consistencia de la recuperación de endotoxinas en todos los serotipos y evaluar las características de rendimiento de cada plataforma.
Diseño del estudio: Comparación de plataformas microfluídicas modernas con pruebas de endotoxinas bacterianas tradicionales
Objetivos del estudio:
- Evaluar la recuperación de diversos serotipos de endotoxinas utilizando el sistema PyroSmart NextGen® rCR de ACC tanto en la plataforma Sievers Eclipse BET como en microplacas de 96 pozos con el lector SpectraMax® de Molecular Devices
- Evalar la comparabilidad de la plataforma entre los métodos de detección microfluídicos y los tradicionales basados en microplacas de 96 pozos
- Caracterizar los parámetros de rendimiento en múltiples fuentes de LPS
Materiales de prueba:
- Soluciones de LPS obtenidas a partir de cepas de microorganismos gramnegativos (Microbiologics KWIK-STIKs)
- Lote de endotoxina estándar de referencia (RSE) R172R0
- PyroSmart NextGen® rCR (ACC)
Métodos:
Se prepararon soluciones crudas de lipopolisacáridos (LPS) a partir de monocultivos de los siguientes microorganismos gramnegativos:
- B. cepacia, derivada de ATCC® 25416™
- E. coli, derivada de ATCC® 8739™
- P. aeruginosa, derivado de ATCC® 10145™
- R. pickettii, derivado de ATCC® 27511™
- S. enterica, derivada de ATCC® 51741™
- S. maltophilia, derivado de ATCC® 13636™
Los cultivos se suspendieron en agua para cultivo celular (WFCC), se calentaron, se agitaron en vórtex y se filtraron a través de filtros de jeringa de 0,2 μM. Las soluciones se diluyeron hasta alcanzar las concentraciones objetivo de 0.5-1.0 EU/mL. También se recolectó agua del grifo y se diluyó hasta alcanzar el mismo objetivo EU/mL.
Como control para el método de extracción de LPS, el WFCC se calentó, se agitó en vórtex y se filtró a través de la misma metodología y se probó para detectar interferencias y contaminación. El control WFCC demostró características de rendimiento equivalentes a las del agua de reactivos LAL (LRW) en los ensayos.
La endotoxina patrón de referencia (RSE, lote R172R0) se preparó en un rango de concentración de 50-0.005 EU/ml mediante dilución en serie y se probó como una curva estándar simultáneamente junto con todas las muestras.
Resultados y conclusiones:
Equivalencia de la plataforma BET y características de rendimiento de rCR
Esta investigación confirma el rendimiento equivalente entre la plataforma BET Sievers Eclipse y la metodología tradicional de placas de 96 pozos en la detección de varios serotipos de endotoxinas bacterianas, incluidas las endotoxinas naturales. Los datos confirman la eficacia de la plataforma Eclipse en el uso de reactivos de cascada recombinantes (rCR) para una recuperación fiable de diversas endotoxinas.
La tecnología microfluídica centrípeta de Eclipse ofrece ventajas operativas, entre ellas la reducción del tiempo de ensayo y la disminución de la posibilidad de errores. Con una sensibilidad de 0.005 EU/mL, el tiempo medio de reacción para RSE en Eclipse fue de 1,692 segundos, lo que representa una reducción del 37 % en comparación con los 2,687 segundos observados con el SpectraMax.
Los hallazgos clave respaldan a la plataforma Eclipse como una solución compatible con las pruebas de endotoxinas, ya que ofrece:
- Mayor eficiencia analítica con un importante ahorro de tiempo
- Disminución de la variabilidad gracias al procesamiento microfluídico automatizado
- Prácticas de prueba sostenibles gracias a la compatibilidad con rCR
- Sensibilidad y precisión mantenidas en diversas fuentes de endotoxinas
Estos resultados contribuyen al creciente cuerpo de evidencia que respalda la adopción de rCR y plataformas microfluídicas avanzadas para aplicaciones de control de calidad farmacéutica.
Más información sobre el Sievers Eclipse
Autores:
- Veronika Wills
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Veronika Wills dirige los grupos de Servicio Técnico Global en Associates of Cape Cod, Inc. Se incorporó al equipo en 2007 y desde entonces se ha convertido en una experta de renombre mundial y oradora pública sobre pruebas de endotoxinas y glucanos. Aporta una vasta experiencia que es vital para los clientes de ACC en lo que respecta a soporte técnico para el análisis de matrices de muestras complejas, la resolución de problemas, la validación de métodos, las investigaciones y los aspectos regulatorios de BET. Últimamente, Veronika se ha dedicado intensamente a la evaluación y la implementación de tecnologías recombinantes y su automatización. Veronika tiene una maestría en Ingeniería Bioquímica del Instituto de Tecnología Química de Praga, República Checa.
- Meg Provenzano
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Meg Provenzano es la directora global de producto de instrumentos de endotoxinas Sievers en Veolia. Tiene más de 10 años de experiencia en el sector de las pruebas de detección de endotoxinas bacterianas y ha ocupado diversos puestos en las áreas de Control de calidad, Asistencia técnica y Gestión de productos. Antes de unirse a Veolia, Meg fue gerente de productos en Charles River Laboratories. Está centrada en el cliente y disfruta de la resolución práctica de problemas, ya sea para cuestiones técnicas, asistencia para ensayos o software. Meg tiene una licenciatura en Ciencias del mar y biología de la Coastal Carolina University, donde se especializó en la investigación de la población de delfines mulares.
- Jake Vincent
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Jake Vincent es especialista en biodetección e investigador principal avanzado de Investigación y desarrollo de Sievers en Veolia, y está especializado en el desarrollo de instrumentos analíticos de biodetección. Como colaborador clave en el analizador de endotoxinas Sievers Eclipse, Jake fue responsable de diseñar los estándares predepositados presentes en el dispositivo microfluídico desechable. La investigación de Jake sobre detección microfluídica de endotoxinas fue publicada en Analytical Chemistry bajo el título "Miniaturization, Parallelization, and Automation of Endotoxin Detection by Centrifugal Microfluidics", donde figura como coautor. Antes de incorporarse a Veolia, Jake colaboró en el desarrollo de métodos analíticos para el ensayo de vacunas contra los flavivirus en Inviragen y Takeda Vaccines, incluyendo los ensayos clínicos de la vacuna contra el dengue, Qdenga. Tiene una licenciatura en ciencias de la Colorado State University.