Como parte de la fabricación de medicamentos parenterales o dispositivos médicos, el cumplimiento de las normas reglamentarias para el control de la contaminación es un paso fundamental para garantizar la seguridad del paciente. Este artículo detallará el Capítulo <85> de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP, por sus siglas en inglés) titulado "Pruebas de endotoxinas bacterianas" (BET, por sus siglas en inglés).
¿Qué es la USP <85> y por qué es importante?
La USP <85> describe los requisitos del compendio para las pruebas de endotoxinas bacterianas. Proporciona las metodologías para detectar o cuantificar endotoxinas utilizando lisado de amebocitos, un compuesto extraído de especies de cangrejos herradura como Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus. Estos tipos de lisado se conocen típicamente como lisado de amebocitos de Limulus, o LAL, o lisado de amebocitos de Taquipleo, o TAL.
¿Por qué hacer pruebas de detección de endotoxinas bacterianas?
Las endotoxinas son biocontaminantes derivados de la membrana celular externa de las bacterias gramnegativas. Si bien no son organismos vivos, son pirógenos altamente peligrosos que pueden producir fiebre en el cuerpo al eludir las defensas digestivas normales. Además, pueden causar una caída severa de la presión arterial, insuficiencia orgánica, shock séptico o incluso la muerte, en ciertas circunstancias.
Debido a que las endotoxinas persisten incluso después de los procesos estándar de desinfección y esterilización, las pruebas rigurosas son absolutamente vitales para los productos y dispositivos de administración que entran en contacto con el torrente sanguíneo o el líquido cefalorraquídeo.
¿A quiénes afecta la USP <85>?
Los organismos reguladores como la Administración Federal de Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) y la Agencia Europea del Medicamento (EMA, por sus siglas en inglés) exigen pruebas de endotoxinas para garantizar que los productos no causen reacciones pirógenas como las descritas anteriormente. Sus regulaciones se aplican a múltiples industrias, que incluyen:
- Fabricantes de productos farmacéuticos que producen medicamentos parenterales que se administran por vía intravenosa, intramuscular e intratecal.
- Fabricantes de dispositivos médicos cuyos productos entran en contacto con el torrente sanguíneo.
- Fabricantes de productos para la salud animal que producen artículos veterinarios en contacto con la sangre.
Nota - esta lista no es exhaustiva.
Métodos de detección de endotoxinas USP <85>
Además de los requisitos compendiales de USP <85> que describen las metodologías para detectar o cuantificar endotoxinas mediante LAL, el capítulo también describe los factores que pueden afectar los resultados al crear inconsistencias o resultados inexactos. Si bien no detalla cómo gestionar o mitigar estos aspectos, destaca la importancia del desarrollo exhaustivo del método como parte de la validación. Puede encontrar información sobre la interpretación y aplicación de los requisitos de USP <85> en "Guidelines on Endotoxins Tests" de USP <1085>.
Métodos de detección
USP <85> detalla tres técnicas comunes para las pruebas de endotoxinas y cómo generan datos; los reactivos necesarios; y cómo garantizar que el ensayo se ejecute de manera que se garantice que los procedimientos y materiales no contribuyan a una posible contaminación o resultados erróneos.
Los tres métodos son:
- Técnica de gel-coágulo: Este método cualitativo o semicuantitativo se basa en la coagulación del reactivo lisado en presencia de endotoxinas.
- Técnica turbidimétrica: Ensayo fotométrico que mide el desarrollo de turbidez (turbidez o cambio en la opacidad) después de la escisión de un sustrato endógeno.
- Técnica cromogénica: Ensayo fotométrico basado en el desarrollo del color tras la escisión de un complejo sintético péptido-cromógeno.
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Idoneidad del método BET e idoneidad específica del producto según USP <85>
La idoneidad del método es un proceso de validación que confirma que un método de prueba de endotoxinas bacterianas es apropiado y confiable para un producto o aplicación específicos, antes de que se use para pruebas de rutina.
¿Qué se debe tener en cuenta en el desarrollo de la idoneidad del método?
Los ensayos de endotoxinas son altamente sensibles. El desarrollo y la idoneidad de los métodos suelen ser específicos del producto para documentar que un fármaco, dispositivo o materia prima no interfiere con la reacción y su método de detección para garantizar resultados válidos. La idoneidad adecuada del método garantiza pruebas de endotoxinas bacterianas confiables, válidas y que cumplen con las normativas.
Criterios de aceptación
Los umbrales de seguridad de los productos farmacéuticos no son de "talla única". Aspectos como la dosis, la duración del uso y la entrega del producto influyen en los criterios de aceptación.
Los fabricantes deben calcular un límite de endotoxinas (EL, por sus siglas en inglés) para cada producto en función de cómo ingresa al cuerpo. La fórmula utilizada es:
EL = K / M
En esta ecuación, K representa el límite de tolerancia del cuerpo (el "umbral de seguridad"), mientras que M representa el "peor de los casos": la dosis máxima de fármaco que un paciente podría recibir por kilogramo de peso corporal por hora.
El factor K cambia drásticamente en función de la vía de administración. Por ejemplo, los productos intravenosos (IV) o intramusculares (IM) se definen como medicamentos que ingresan al torrente sanguíneo o a los músculos. El límite de tolerancia para los productos IV e IM es mayor, ya que el riesgo es menor debido al tipo de entrega. En comparación, los fármacos inyectados directamente en la médula espinal o el cerebro, denominados fármacos intratecales (IT), suelen tener un límite de tolerancia más bajo, ya que el riesgo de reacción adversa es mayor. Esto significa que un medicamento para la columna vertebral debe contener una carga de endotoxinas más baja que un goteo intravenoso estándar.
Además, existen cálculos adicionales que tienen en cuenta si un fármaco es una dosis única o un goteo continuo, ya que la tasa de administración cambia el perfil de riesgo. Estos cálculos tienen en cuenta factores como el peso o el tipo de paciente. Las matemáticas basadas en el peso también son la razón por la que los medicamentos pediátricos y veterinarios a menudo tienen ELs significativamente más bajos, ya que los pacientes más pequeños tienen un umbral más bajo para la exposición a las endotoxinas.
Esto formará parte de los cálculos de la dilución máxima válida (MVD), como se describe a continuación.
Sensibilidad LAL
El lisado tiene varios factores que contribuyen a la inconsistencia en la sensibilidad.
El LAL no es un compuesto único, sino una mezcla de enzimas producidas por los amebocitos, cada una de las cuales contribuye a la reacción en cascada. Debido al hecho de que se producen en la naturaleza, estas enzimas pueden variar en cantidad y sensibilidad y carecen de la consistencia común a los reactivos fabricados.
La cascada LAL es un sistema de amplificación enzimática altamente sensible que detecta endotoxinas a través de una serie de activaciones enzimáticas y permite la detección rápida y específica de endotoxinas. La reacción en cascada es la razón por la cual las pruebas de LAL son el estándar de oro para la detección de endotoxinas bacterianas en industrias reguladas.
Es importante tener en cuenta la variabilidad potencial, ya que afecta a los resultados y compromete la reproducibilidad de los experimentos. La variación es un factor en los cálculos de dilución máxima válida (MVD), que se etiqueta como λ.
El LAL comienza a reaccionar y degradarse inmediatamente después de la reconstitución. Mientras que la refrigeración ralentizará la actividad, pero no detendrá la degradación. Esta variación debe tenerse en cuenta en todos los ensayos y puede lograrse de las siguientes maneras:
- * Una curva estándar: una calibración de la reactividad del reactivo actual utilizando un mínimo de 3 puntos (u 4 para el método de gel-coágulo).
- * Controles positivos de productos (PPC, por sus siglas en inglés): Muestras enriquecidas con una cantidad conocida de endotoxina para demostrar que la prueba realmente puede detectarla dentro de ese medicamento específico.
- * Controles negativos: LAL mezclado con agua reactiva LAL (LRW) para establecer una línea de base.
La inestabilidad del LAL se puede observar en los controles negativos. Si se les da suficiente tiempo, eventualmente reaccionarán. Esta sensibilidad inherente es la razón por la que la prueba es tan efectiva, pero exige disciplina de procedimiento.
Límite de endotoxinas y dilución máxima válida (MVD)
La dilución máxima válida (MVD) es la dilución máxima permitida de una muestra en la que se puede determinar el límite de endotoxinas. Tiene en cuenta tanto el cálculo del límite de endotoxinas como la sensibilidad al LAL, pero proporciona el factor de dilución para evitar interferencias.
MVD = (límite de endotoxinas (EL) × concentración de la solución de muestra)/(λ)
λ es la sensibilidad marcada del lisado o la concentración más baja utilizada en la curva estándar.
Este cálculo tiene en cuenta que las muestras pueden contener sustancias que inhiben la detección de endotoxinas (causando falsos negativos) o la mejoran (causando falsos positivos).
Materiales, accesorios y su impacto en las pruebas de endotoxinas
La fuente de interferencia potencial se extiende más allá de la muestra en sí, y el manejo adecuado de la muestra es una consideración que afecta la precisión de la prueba.
Los materiales utilizados para la recolección y almacenamiento de muestras son oportunidades para introducir contaminación. La USP <85> destaca que:
- Los herrajes diseñados para su reutilización, como las bandejas metálicas, deben ser despirogenados.
- Los elementos como las puntas de pipeta, los tubos de dilución y las microplacas deben analizarse para confirmar que están libres de endotoxinas detectables, ya sea basándose en el certificado de análisis (CoA) de un proveedor o mediante pruebas internas.
- Se sabe que ciertos materiales, como las pipetas serológicas de plástico, causan interferencias y deben evitarse.
Se recomienda que los protocolos de prueba eviten el uso de accesorios que contengan plásticos como el polipropileno, ya que se sabe que adsorbe endotoxinas y podría causar un subregistro.
Cuando se trata de endotoxinas, un falso negativo es especialmente peligroso para la seguridad del paciente porque las reacciones pirógenas pueden ser graves.
Descargar ahora: Selección y cribado de accesorios y materiales en BET
Contaminación por beta glucano
Los betaglucanos (β-glucanos) pueden introducirse cuando se introduce material vegetal u hongos como parte de la preparación de la muestra, como mediante el uso de una punta de pipeta filtrada.
Los betaglucanos son carbohidratos complejos compuestos por moléculas de glucosa unidas por enlaces β-glucosídicos. También conocidos como polisacáridos, se encuentran de forma natural en innumerables organismos, como levaduras, hongos, bacterias, algas y cereales como la avena y la cebada. Los hongos y las levaduras contienen las concentraciones más altas de betaglucanos, y su prevalencia significa que el riesgo de contaminación es considerable.
Los betaglucanos interfieren con los resultados, causando resultados falsos positivos al activar el LAL a través de una vía diferente a la de las endotoxinas.
Cómo superar la interferencia de BET
La USP <85> exige que los factores interferentes se consideren como parte del desarrollo del método, y que la recuperación debe estar dentro del rango del 50% al 200%. Si la recuperación está fuera de este rango, hay interferencias.
A menudo, las interferencias pueden superarse mediante:
- Diluir la muestra, pero la dilución no puede exceder la MVD
- Aplicación de tratamientos validados adecuados, como filtración, neutralización, diálisis o tratamiento térmico.
- Usar un tampón bloqueador de glucanos si hay betaglucanos presentes, ya que el LAL a veces puede reaccionar a los glucanos además de las endotoxinas
Descargar ahora: Protocolo de inhibición/mejora para pruebas de endotoxinas bacterianas
Integridad de los datos y BET
Las pruebas tradicionales, particularmente con el método de coágulos de gel, son manuales tanto en las operaciones como en la determinación del punto final. Para esta prueba, la creación de un coágulo se confirma con la inspección visual de un tubo. Esta naturaleza manual no solo requiere mucho tiempo, sino que está abierta a la interpretación, lo que la hace propensa al error humano. Esto puede comprometer la integridad de los datos.
Para mitigar estos riesgos, los laboratorios están recurriendo a ensayos con datos cuantitativos. Estas plataformas toman múltiples lecturas utilizando software compatible y proporcionan una transmisión de datos segura, registros de auditoría completos específicos del ensayo y un estricto cumplimiento de 21 CFR Parte 11 y las características de cumplimiento de integridad de datos de ALCOA+. Además, estas opciones ofrecen una variedad de opciones de automatización, incluida la dilución de muestras y el pipeteo.
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Podemos ayudarle a cumplir con la norma USP <85>
Adherirse a USP <85> puede ser complejo y llevar mucho tiempo. Al implementar la plataforma de pruebas de endotoxinas bacterianas Sievers Eclipse , nuestros especialistas en BET se convierten en sus socios de instalación e implementación. Desde los estudios de viabilidad hasta la validación de métodos y el desarrollo de SOP, nuestro equipo puede ayudarlo a optimizar la implementación y, al mismo tiempo, garantizar un cumplimiento perfecto durante todo el turno.
El Sievers Eclipse proporciona una detección rápida y cuantitativa de endotoxinas que brinda a las instalaciones de todos los tamaños la eficiencia, confiabilidad y confianza en el cumplimiento que necesitan. Vea lo que dicen nuestros clientes.
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Autores:
- Meg Provenzano
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Meg Provenzano es la gerente global de productos de instrumentos para endotoxinas Sievers en Veolia. Tiene más de 10 años de experiencia en el sector de las pruebas de detección de endotoxinas bacterianas y ha ocupado diversos puestos en las áreas de Control de calidad, Asistencia técnica y Gestión de productos. Antes de unirse a Veolia, Meg fue gerente de productos en Charles River Laboratories. Está centrada en el cliente y disfruta de la resolución práctica de problemas, ya sea para cuestiones técnicas, asistencia para ensayos o software. Meg tiene una licenciatura en Ciencias del mar y biología de la Coastal Carolina University, donde se especializó en la investigación de la población de delfines mulares.
- Sydney Jannetta
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es gerente de marketing en Veolia y se especializa en la línea de productos de instrumentos analíticos Sievers. Sydney ha apoyado a los clientes de Sievers durante los últimos diez años con experiencia en aplicaciones de carbono orgánico total (TOC) y endotoxinas. Ha brindado servicios de desarrollo de métodos y pruebas de viabilidad a fabricantes farmacéuticos y ha participado en más de 20 conferencias nacionales. Sydney es licenciada en Química por la Universidad del Norte de Colorado.
- Lindsey Wohlman
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es especialista en marketing en Veolia y da soporte a la línea de instrumentos analíticos Sievers. Colabora estrechamente con ingenieros, científicos y expertos en productos para desarrollar contenido que transforme la información técnica en conocimientos prácticos para los clientes y las partes interesadas de B2B. Su experiencia como especialista en marketing digital full-stack en tecnología, software y fabricación le ha dado un profundo aprecio por el papel que desempeña la comunicación clara en el impulso de la comprensión y la creación de confianza. Lindsey tiene dos licenciaturas en Artes de la Universidad de Colorado.