En la actualidad, la mayoría de los fabricantes de dispositivos médicos y farmacéuticos utilizan lisado de amebocitos de limulus (LAL), la sangre de los cangrejos herradura, para detectar endotoxinas bacterianas. Las pruebas son fundamentales para detectar contaminantes peligrosos y potencialmente mortales, pero, desde el punto de vista de la sostenibilidad, ejercen presión sobre la población de cangrejos herradura. Los cangrejos son el reactivo natural de detección de endotoxinas más sensible e inigualable del planeta. La mayoría de los recolectados y desangrados por la industria biomédica son, según lo requerido por la Planta de Manejo Pesquero (FMP), liberados vivos al agua de donde fueron recolectados; sin embargo, una parte de estos cangrejos mueren por el procedimiento1. Por esta razón, en los últimos años se han desarrollado métodos alternativos de endotoxinas bacterianas. El factor C recombinante (rFC, por sus siglas en inglés) y los reactivos en cascada recombinantes (rCR, por sus siglas en inglés) son dos métodos alternativos que no utilizan sangre de cangrejo herradura.
La rFC es la primera enzima de coagulación en el mecanismo de coagulación de la sangre del cangrejo herradura, y un clon de este factor C se utiliza para el método rFC. Funciona haciendo que un lector de fluorescencia amplifique un sustrato fluorogénico para detectar la presencia de endotoxinas. La Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, por sus siglas en inglés) ha reconocido el rFC como un método alternativo, pero requiere pruebas de equivalencia con los métodos BET compendiales más comunes, de acuerdo con los requisitos de la USP <85>Prueba de endotoxinas bacterianas y el Capítulo <1225>Validación de procedimientos compendiales de la USP2.
Los reactivos recombinantes en cascada, o rCR, utilizan los mismos factores que los reactivos LAL tradicionales que se encuentran en la sangre del cangrejo herradura, pero al utilizar un proceso de fabricación recombinante3, se considera un método alternativo. El uso de un reactivo recombinante contiene todos los factores de coagulación y utiliza un ensayo cinético tradicional en un lector de absorbancia, lo que lo convierte en una prueba libre de animales para BET. Las empresas que adoptan este método de ensayo también deben someterse a las mismas pruebas de validación/equivalencia que rFC.
Aunque estos métodos son más sostenibles para la población de cangrejos herradura, validar e implementar un método alternativo para BET puede llevar mucho tiempo y ser riguroso, y hacer que muchas empresas busquen una opción más simple, pero también sostenible, para probar los productos en busca de endotoxinas.
La plataforma de pruebas de endotoxinas bacterianas (BET) Sievers Eclipse es una solución que ofrece ventajas significativas en términos de reducción de LAL y adherencia al compendio. Si bien no es un método alternativo, al realizar un protocolo IQ/OQ/PQ completo y pruebas y validaciones sólidas similares a los requisitos de USP <1225>, los usuarios tendrán plena confianza en su validación. El Eclipse utiliza LAL de cangrejo herradura con licencia de la FDA disponible en el mercado, pero reduce el uso de LAL hasta en un 90 por ciento en comparación con los métodos tradicionales de LAL, como la placa de 96 pocillos y el coágulo de gel. Al desarrollar el Eclipse, se diseñó una microplaca ultramoderna para facilitar la dispersión precisa y rápida de LAL y muestras utilizando fuerza centrípeta, cámaras de medición y canales microfluídicos. El sistema de microfluidos utiliza la misma bioquímica que los ensayos de endotoxinas tradicionales, pero con un esfuerzo práctico mínimo, mayor consistencia y una reducción drástica del consumo de LAL, hasta en un 90 %, como se mencionó.
La plataforma de pruebas de endotoxinas bacterianas (BET) Sievers Eclipse se está convirtiendo rápidamente en un método de prueba de elección de BET porque permite a los fabricantes de dispositivos médicos y farmacéuticos proteger los valiosos recursos naturales y cumplir con los objetivos de sostenibilidad, al tiempo que cumple con los estrictos requisitos analíticos y reglamentarios de la farmacopea global armonizada USP <85>, EP 2.6.14 y JP 4.01.
Comparación de los métodos de prueba de LAL
Autor: Hayden Skalski, especialista en aplicación de productos para ciencias biológicas, Veolia Water Technologies & Solutions, Sievers Instruments
Hayden es el especialista en aplicación de productos de ciencias biológicas para la línea de productos de Sievers Instruments, que se especializa en pruebas de endotoxinas bacterianas (BET). Hayden tiene más de 8 años de experiencia en la industria farmacéutica y en microbiología de control de calidad, y ha realizado presentaciones sobre numerosos temas relacionados con las pruebas de endotoxinas. Anteriormente, Hayden ocupó cargos en Charles River Laboratories, Regeneron y Novartis, donde validó y ejecutó protocolos de desarrollo de métodos para pruebas de endotoxinas, brindó asistencia al cliente, resolvió problemas y brindó soporte para pruebas de productos de alto volumen. Hayden tiene una licenciatura en Biología de la Universidad de Albany (SUNY).
- Referencias
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1. Comisión de Pesquerías Marinas de los Estados del Atlántico. (s.f.). Cangrejo herradura. Obtenido de http://www.asmfc.org/species/horseshoe-crab
2. Administración de Alimentos y Medicamentos del Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU. (2012, junio). Guía para la industria: Pruebas de pirógenos y endotoxinas: preguntas y respuestas
3. Asociados de Cape Cod Incorporated. (s.f.). Reactivo LAL recombinante PyroSmart NextGen™ Instrucciones de uso.